پروتکل های تحقیقاتی
- 1
-
پروتکل ساخت کامپتنت الکتریکی
- یک تک کلون از باکتری E.coli در 10 میلی‌لیتر محیط LB به مدت 12 ساعت در 37 درجه به همراه شیک کردن کشت داده میشود.
- نیم سی سی از کشت شبانه فوق به 50 سی سی محیط مایع LB اضافه شده و به مدت 3 الی 4 ساعت (تا زمانی که شدت جذب در OD 600 نانومتر به 0.5 برسد) در شیکر انکوباتور 37 درجه کشت داده میشود.
- کشت باکتری به یک فالکون 50 میلی‌لیتری منتقل و در دمای4 درجه و دور rpm 3500 به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شود.
- رسوب حاصل در 50 میلی‌لیتر محلول سرد آب مقطر سرد استریل حل شده و 10 دقیقه روی یخ قرار داده شود.
- سانتریفیوژ مانند مرحله قبل انجام شود.
- رسوب حاصل در 25 میلی‌لیتر محلول سرد آب مقطر سرد استریل حل شده و 10 دقیقه روی یخ قرار داده شود.
- سانتریفیوژ مانند مرحله قبل انجام شود.
- به رسوب حاصل 12 میلی‌لیتر محلول سرد آب مقطر سرد استریل اضافه شده و سانتریفیوژ انجام شود.
- رسوب حاصل در 600 میکرولیتر محلول سرد آب مقطر سرد استریل حل شده و در حجم‌های 100 میکرولیتری تقسیم شده و از آنها در همان روز استفاده شود.
نکته: تمام مراحل در کنار شعله انجام شود تا از ایجاد آلودگی جلوگیری شود.
ادامه مطلب
-
تهیه باكتری مستعد[1] شده برای واكنش شیمیایی
- یک تک کلون از باکتری E.coli در 10 میلی‌لیتر محیط LB به مدت 12 ساعت در 37 درجه به همراه شیک کردن کشت داده میشود.
- نیم سی سی از کشت شبانه فوق به 50 سی سی محیط مایع LB اضافه شده و به مدت 3 الی 4 ساعت (تا زمانی که شدت جذب در OD 600 نانومتر به 0.5 برسد) در شیکر انکوباتور 37 درجه کشت داده میشود.
- کشت باکتری به یک فالکون 50 میلی‌لیتری منتقل و در دمای4 درجه و دور rpm 3500 به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شود.
- رسوب حاصل در 50 میلی‌لیتر محلول سرد (CaCl2(50 mM حل شده و 10 دقیقه روی یخ قرار داده شود.
- سانتریفیوژ مانند مرحله قبل انجام شود.
- رسوب حاصل در 25 میلی‌لیتر محلول سرد (CaCl2(50 mM حل شده و 10 دقیقه روی یخ قرار داده شود.
- سانتریفیوژ مانند مرحله قبل انجام شود.
- به رسوب حاصل 12 میلی‌لیتر محلول سرد (CaCl2(50 mM اضافه شده و سانتریفیوژ انجام شود.
- رسوب حاصل در 600 میکرولیتر محلول سرد (CaCl2(50 mM حل شده و در حجم‌های 100 میکرولیتری تقسیم شده و از یکی از آنها در همان روز استفاده شود.
به مابقی گلیسرول اضافه و در فریزر 70- ذخیره شوند. برای اطمینان از عدم آلودگی میكروبی باكتری پذیرای (مستعد) تهیه شده 50 میکرولیتر از آن را روی پلیتهای جامد بدون آنتی بیوتیك و دارای آنتی بیوتیكهای آمپی سیلین، كانامایسین و تتراسایكلین كشت داده و یك شب در انكوباتور C°٣٧ بطور ساكن قرار گیرد. باكـتری E.coli تنها باید روی پلیت بدون آنتی بیوتیك رشدكند چون ژن مقاومت به هیچ یك ازآنتی بیوتیكها را ندارد. با مشاهده هرگونه آلودگی در پلیتهای فوق، باید میكروتیوبهای حاوی سلول‌های پذیرا دور ریخته و معدوم شوند.
نکته: تمام مراحل در کنار شعله انجام شود تا از ایجاد آلودگی جلوگیری شود.
[1]- Competent
ادامه مطلب