تهیه باکتری مستعد^[1] شده برای واکنش شیمیایی

• یک تک کلون از باکتری E.coli در 10 میلی‌لیتر محیط LB به مدت 12 ساعت در 37 درجه به همراه شیک کردن کشت داده میشود.
• نیم سی سی از کشت شبانه فوق به 50 سی سی محیط مایع LB اضافه شده و به مدت 3 الی 4 ساعت (تا زمانی که شدت جذب در OD 600 نانومتر به 0.5 برسد) در شیکر انکوباتور 37 درجه کشت داده میشود.
• کشت باکتری به یک فالکون 50 میلی‌لیتری منتقل و در دمای4 درجه و دور rpm 3500 به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شود.
• رسوب حاصل در 50 میلی‌لیتر محلول سرد (CaCl₂(50 mM حل شده و 10 دقیقه روی یخ قرار داده شود.
• سانتریفیوژ مانند مرحله قبل انجام شود.
• رسوب حاصل در 25 میلی‌لیتر محلول سرد (CaCl₂(50 mM حل شده و 10 دقیقه روی یخ قرار داده شود.
• سانتریفیوژ مانند مرحله قبل انجام شود.
• به رسوب حاصل 12 میلی‌لیتر محلول سرد (CaCl₂(50 mM اضافه شده و سانتریفیوژ انجام شود.
• رسوب حاصل در 600 میکرو‌لیتر محلول سرد (CaCl₂(50 mM حل شده و در حجم‌های 100 میکرولیتری تقسیم شده و از یکی از آنها در همان روز استفاده شود.

به مابقی گلیسرول اضافه و در فریزر 70- ذخیره شوند. برای اطمینان از عدم آلودگی میکروبی باکتری پذیرای (مستعد) تهیه شده 50 میکرولیتر از آن را روی پلیتهای جامد بدون آنتی بیوتیک و دارای آنتی بیوتیکهای آمپی سیلین، کانامایسین و تتراسایکلین کشت داده و یک شب در انکوباتور C°37 بطور ساکن قرار گیرد. باکـتری E.coli تنها باید روی پلیت بدون آنتی بیوتیک رشدکند چون ژن مقاومت به هیچ یک ازآنتی بیوتیکها را ندارد. با مشاهده هرگونه آلودگی در پلیتهای فوق، باید میکروتیوبهای حاوی سلول‌های پذیرا دور ریخته و معدوم شوند.

نکته: تمام مراحل در کنار شعله انجام شود تا از ایجاد آلودگی جلوگیری شود.

[1]- Competent

پروتکل ساخت کامپتنت الکتریکی

• یک تک کلون از باکتری E.coli در 10 میلی‌لیتر محیط LB به مدت 12 ساعت در 37 درجه به همراه شیک کردن کشت داده میشود.
• نیم سی سی از کشت شبانه فوق به 50 سی سی محیط مایع LB اضافه شده و به مدت 3 الی 4 ساعت (تا زمانی که شدت جذب در OD 600 نانومتر به 0.5 برسد) در شیکر انکوباتور 37 درجه کشت داده میشود.
• کشت باکتری به یک فالکون 50 میلی‌لیتری منتقل و در دمای4 درجه و دور rpm 3500 به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شود.
• رسوب حاصل در 50 میلی‌لیتر محلول سرد آب مقطر سرد استریل حل شده و 10 دقیقه روی یخ قرار داده شود.
• سانتریفیوژ مانند مرحله قبل انجام شود.
• رسوب حاصل در 25 میلی‌لیتر محلول سرد آب مقطر سرد استریل حل شده و 10 دقیقه روی یخ قرار داده شود.
• سانتریفیوژ مانند مرحله قبل انجام شود.
• به رسوب حاصل 12 میلی‌لیتر محلول سرد آب مقطر سرد استریل اضافه شده و سانتریفیوژ انجام شود.
• رسوب حاصل در 600 میکرو‌لیتر محلول سرد آب مقطر سرد استریل حل شده و در حجم‌های 100 میکرولیتری تقسیم شده و از آنها در همان روز استفاده شود.  

نکته: تمام مراحل در کنار شعله انجام شود تا از ایجاد آلودگی جلوگیری شود.